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產品簡介

單細胞測序技術(single cell sequencing)是在單個細胞水平上,揭示全基因組范圍內的所有基因表達情況,包括鑒定組織細胞類型,反映不同樣本間的細胞異質性和組織微環境。

“烈冰智造計劃”于2021年9月,成功突破國外技術壟斷壁壘,發布“烈冰智造”第一款,用于單細胞測序的實驗耗材——PanoCell雙通道微孔芯片!該芯片完美適配BD平臺全套原裝試劑,磁珠和Protocol,實現國產芯片和國際主流平臺的完美結合,為單細胞測序提供高質量、高效率、高性價比的服務方案!


我們的優勢

1. 自主研發PanoCell微孔芯片,搭配BD Rhapsody單細胞平臺+BD磁珠+BD全套原裝試劑及protocol;
2. 具有豐富的、針對不同樣本類型的單細胞懸液制備經驗,如:外周血、細胞系、新鮮/凍存器官組織、腫瘤組織,確保細胞活性達到測序要求;
3. 擁有成熟的單細胞測序文庫構建技術,一次性完成1000-10000個細胞的文庫構建,真正測全組織中所有細胞類型,做到對樣本中所有類型細胞的全面解析;
4. 具備完善的單細胞測序和實驗質控流程,以及豐富的單細胞測序和數據分析經驗,實現個性化、定制化數據分析服務。

樣本要求

樣本類型:

組織、血液、培養的細胞系、制備好的單細胞懸液

注:若客戶樣本為組織,且無能力進行組織解離來獲取單細胞懸液,烈冰將盡可能提供技術及實驗上的幫助,但因不同類型樣本的特異性,無法保證實驗方法適用于所有類型組織。

質量要求:

1. 細胞活性大于70%

2. 濃度為500-2000細胞/μl

3. 體積不小于200μl

4. 細胞培養基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+

5. 細胞體積小于40μm

實驗流程


1. 單細胞懸液制備:根據樣本特性選擇合適的單細胞懸液制備方法,注意紅細胞裂解;如若客戶樣本為已經制備好單細胞懸液,該步驟可以省略;

2. 細胞活性檢測:細胞活性需大于70%;

3. 單細胞捕獲:通過分選平臺(BD)對每個細胞進行捕獲;

4. 細胞/轉錄本標簽添加:對結合磁珠標簽的RNA進行逆轉錄引入CB和UMI;

5. 文庫構建:對cDNA進行隨機引物PCR擴增;

6. 上機測序:烈冰推薦Illumina Hiseq或NovaSeq測序平臺,數據量100G/樣本。

數據分析流程



結果示例

1、單細胞懸液制備(附加收費項目)
根據研究目的和對象獲取新鮮的樣本,包括不同類型的腫瘤樣本及其對應的正常樣本。再根據組織樣本的特性,選擇合適的消化條件(酶液、消化溫度和時間),過篩后獲得所需單細胞懸液。

單細胞懸液的制備流程

2、單細胞計數和活性檢測
將細胞從培養液體系更換為上樣緩沖液體系(Sample Buffer),采用Countstar或BD Rhapsody Scanner能夠準確判斷細胞數量以及活性狀態。(注意:當紅細胞/死細胞比例過多時,建議去除此類細胞,保證有效數據量。)

注:活細胞檢測明場圖(左),綠色熒光(中),紅色熒光(右)

3、單細胞捕獲
采用BD Rhapsody單細胞捕獲平臺,將每個細胞及其mRNA標記上對應的標簽。將收集的帶上磁珠標簽的RNA進行反轉錄,產物可于4℃環境下帶回公司進行后續操作。

BD Rhapsody?單細胞分析系統的誕生基于 BD 在細胞生物學領域 40年的專業技術, 采用CytoSeq技術進行單細胞捕獲。應用烈冰PanoCell微孔芯片(包含20W+的微孔(該數量級遠大于Input細胞數量)),搭配BD平臺磁珠+全套試劑+protocol,保證單孔中的單細胞捕獲。同時避免了傳統微流控系統中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題,采用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率,保證Input細胞的全面使用。

4、高通量測序
PCR擴增后開始進行文庫構建,獲得每個樣本的測序文庫。接著采用Illumina Hiseq或NovaSeq高通量測序儀對單細胞轉錄組文庫進行測序,獲得每個樣本的測序數據。

NovaSeq 6000測序儀

5、細胞數量判斷
采用Fastp軟件對下機原始數據進行質控,對質控后測序數據中的cell barcode信息及其對應的counts數進行統計,判斷測序樣本中實際檢測到的細胞數量,獲得樣本的測序細胞數,并根據最終確認的cell barcode信息提取對應的reads。

注:橫坐標為細胞數量,縱坐標為每個細胞對應的平均counts數,根據曲線的斜率判斷實際檢測的細胞數量

6、基因組比對和表達量統計
以cell barcode對應的reads為研究對象,采用STAR算法將測序數據比對到物種對應的基因組上,獲得基因組比對的bam文件。再以bam文件以及基因組注釋文件為研究對象,將比對到同一基因上的UMI進行合并,并去除其中重復的UMI序列,得到每個基因的UMI數量,統計每個細胞中檢測到的基因數以及轉錄本數量,并得到表達量矩陣表。

注:左圖為細胞中總共檢測到的基因數量,右圖為去除重復UMI后統計的基因數量

7、細胞過濾和數據標化
利用基因組比對結果以及表達量結果對測序檢測到的細胞進行過濾,去除細胞中基因檢測數少、線粒體基因占比大的細胞,統計過濾后的細胞數量并得到對應的表達量矩陣表。采用數據標準化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),對不同樣本中細胞基因表達量進行標準化,得到標準化后的表達量矩陣表。

注:橫坐標表示每個細胞中UMI的數量,縱坐標表示線粒體基因的占比情況

8、細胞亞群分析
基于每個細胞中的基因表達量數據,采用聚類算法對細胞進行亞群分析,同時采用t-SNE分析對細胞的分群結果進行可視化展示。同時,還可以對不同樣本中各細胞亞群的占比情況進行統計分析。

Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注:左圖為前列腺腫瘤組織細胞亞群鑒定t-SNE圖展示;右圖細胞亞群分群情況

9、Marker基因鑒定
鑒定不同細胞亞群中的Marker基因,并對Marker基因的表達分布進行可視化展示


Zhang et al., Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.

注: marker基因的Feature Plot圖和Violin圖



10、差異基因篩選
針對所有或者特定細胞亞群,進行細胞亞群間差異表達基因篩選,獲得細胞亞群間差異表達基因。

Zhang, et al. Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.

注:該圖為不同細胞亞群間差異基因聚類分析Heatmap

11、功能分析(GO Analysis)和信號通路分析(Pathway Analysis)
分別采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數據庫,以及KEGG數據庫,對Marker基因/差異基因進行功能分析和信號通路分析,從而得到這些基因群體所顯著性富集的GO條目和Pathway條目。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.

注:該圖為不同cluster之間差異基因顯著富集的GO/Pathway條目

12、SCENIC分析
基于已知的轉錄因子靶點數據庫,以及轉錄因子和靶基因的表達矩陣,采用SCENIC算法,對于轉錄因子的調控網絡進行計算,得到在每一個細胞中表達的轉錄因子的調控基因以及調控強度。


Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077

注:該圖為不同cluster之間轉錄因子調控強度heatmap圖


13、QuSAGE分析
基因集表達激活度定量分析,采用方差膨脹因子(VIF)診斷共線性的方法對于諸如KEGG基因集、GSEA基因集、甚至研究者自己搜集的基因集在Cluster中的富集度進行分析,比較不同Cluster所富集的基因集的差異。


Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注:該圖為不同cluster之間信號同理調控強度熱圖


高級數據分析
1、擬時序分析
以細胞的表達量數據為研究對象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虛擬時間軸上對細胞的變化模式進行分析,模擬重建細胞的動態變化過程,獲得細胞間的狀態轉換關系,以及不同狀態細胞間差異基因的表達情況。



Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注:細胞間狀態轉換的pesudotime軌跡圖(左)、軌跡中細胞占比餅圖 和 Heatmap圖(右)



2、細胞通訊分析
以細胞亞群的基因表達量數據為研究對象,獲得細胞中的配體及受體基因的表達信息,采用Cellphone DB算法以及數據庫,得到細胞亞群間的信號通訊關系,并計算獲得關系的顯著性和強度。

Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077

注:左圖:橫坐標表示細胞類型,縱坐標表示細胞間通訊配受體關系,圓圈大小表示顯著性差異水平,圓圈顏色越紅表示細胞間通訊關系越強



3、TCGA預后聯合分析
以TCGA臨床信息以及篩選到的關鍵基因為研究對象,結合TCGA臨床數據,進行預后分析,獲得該基因/基因集與臨床預后之間的關系。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.

注:橫坐標表示生存期,縱坐標表示占比,不同顏色曲線代表不同分組


文獻示例

[1] The zinc finger protein Miz1 suppresses liver tumorigenesis by restricting hepatocyte-driven macrophage activation and inflammation[J]. Immunity, 2021.IF=31.745


[2] Huang et al., Multiomics analyses reveal a critical role of selenium in controlling T cell differentiation in Crohn’s disease[J]. Immunity, 2021. IF=31.745


[3] Single cell analysis reveals transcriptomic remodellings in distinct cell types that contribute to human prostate cancer progression[J]. Nature Cell Biology, 2021,23, 87–98.IF=28.821


[4] Sun H , Wen X , Li H , et al. Single-cell RNA-seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2019, 79(3):annrheumdis-2019-215926.IF=19.101


[5] Multiomics analysis reveals a distinct response mechanism in multiple primary lung adenocarcinoma after neoadjuvant immunotherapy[J]. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2021;9:e002312.IF=13.751


[6] He Y , Yuan H , Wu C , et al. DISC: a highly scalable and accurate inference of gene expression and structure for single-cell transcriptomes using semi-supervised deep learning[J]. Genome biology, 2020, 21(1). IF=13.584


[7]  Zhaohui Chen, Lijie Zhou, et al.Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma[J]. Nature Communications, 2020, 11:5077.IF=14.91


[8] The molecular taxonomy of primate amygdala via single-nucleus RNA-sequencing analysis[J].Science Bulletin, 2020IF=11.78


[9] Intra-heterogeneity in transcription and chemoresistant property of leukemia-initiating cells in murine Setd2?/? acute myeloid leukemia[J].Cancer Communication,2021,1-22.IF=10.392


[10] Identification of Monocytes Associated with Severe COVID-19 in the PBMCs of Severely Infected Patients Through Single-Cell Transcriptome Sequencing[J].Engineering, 2021. IF=7.553


[11] Pijuan-Sala B, Griffiths JA, Guibentif C, et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):490-495.(IF=41.577)


[12] Cao J, Spielmann M, Qiu X, et al. The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):496-502.(IF=41.577)